Osmanlıların zaferi ile sonuçlanan Cerbe Muharebesi'nden sonra dikkatler Malta'ya çevrilmiştir. Bu zafer, Osmanlıların Batı Akdeniz'den çıkarılamayacağını bir kez daha ortaya koymuştu. Mısır, Trablusgarp, Cezayir ve diğer önemli yerlerin idare ve güvenliği, Malta'nın Osmanlı idaresine geçmesini gerekli kılıyordu. Daha önce Rodos Adası'nın Osmanlılar tarafından fethi ardından, Malta Adası, Şarlken tarafından buradan çıkarılan Saint Jean şövalyelerine verilmişti. Ada, kısa sürede şövalyeler tarafından oldukça müstahkem hale getirilmişti.

Cezayir yolu üzerindeki adada bulunan şövalyeler, korsanlık faaliyetlerini sürdürmekteydi. Türk ticaret gemilerine saldırarak Osmanlı ticaretine zarar veriyor ve Osmanlılar aleyhine olan savaşlara (Preveze ve Cerbe gibi) katılıyorlardı. Ayrıca Hristiyan korsan gemileri de burada kendileri için güvenli bir sığınak buluyordu. Bütün bu sebepler göz önüne alındığında, Osmanlılar açısından Malta'nın fethi kaçınılmaz bir gereklilik olarak ortaya çıkmaktaydı. İspanyollar ise Malta'nın fethinin sonunda Osmanlı donanmasının Sicilya, Napoli ve çevresine geleceğini bildiklerinden, Malta'nın savunmasına büyük önem veriyorlardı.

Osmanlılar, Malta seferi konusunda pek istekli görünmüyor veya en azından acele etmiyorlardı. Ancak saray için alınan eşyayı getiren bir Türk gemisinin Zenta ve Kefalonya adaları arasında yedi Malta korsan gemisi tarafından zapt edilmesi, adanın Osmanlılar tarafından fethi konusundaki düşünceleri değiştirdi. Yıllardan beri "ahali-i İslâm-i nusret encâma zarar ve haşaretten hâli olmayan" Malta şövalyelerine ait "kıla' ve buka'în kal' ve kam'ına" karar verilince, büyük bir hazırlığa girişildi. Haliç, Gelibolu ve Sinop tersanelerinde yeni gemiler inşa edilirken, mevcut gemiler tamir edilip kalafatlandı. Bazı gönüllü reisler için Rodos'ta 18 oturaklı kaliteler yaptırıldı.

Malta üzerine gönderilecek kuvvetlere Beşinci Vezir Kızılahmedlü Mustafa Paşa serdar tayin edilerek seferin tüm yetkisi kendisine verilmişti. Donanma ise Cerbe galibi Cezayir Beylerbeyi Kaptan-ı Derya Piyale Paşa'nın emrine verilmişti. Ayrıca Beylerbeyi Turgut Paşa'ya (Reis) da emirler gönderilerek, Piyale Paşa'ya yardımda bulunması istenmişti. Osmanlı donanması, 29 Mart 1565'te 300'e yakın gemi ve 40-50 bin kişilik muazzam bir ordu ile Malta'ya hareket etti. 19 Mayıs'ta adaya varılarak karaya asker çıkarıldı.

Kanuni Sultan Süleyman'ın emir ve tavsiyelerine rağmen, çok tecrübeli bir denizci olan Turgut Reis gelmeden kuşatmaya başlandı ve yanlış mevkilere hücum edildi. Turgut Reis'in aldığı önlemlerle bu hatalar düzeltildi. Ancak Turgut Reis, 18 Haziran'da Sant Elmo burçları önünde bir top güllesinin çarptığı kayadan fırlayan bir taşın başına isabet etmesiyle yaralandı. Dört gün komada kaldıktan sonra, burçların fethedildiği beşinci gün olan 23 Haziran'da vefat etti. Cesedi, beş parça kadırgayla Trablus'a gönderilip, orada yaptırdığı cami ve medresesinin yanındaki türbesine defnedildi.

Saint Elmo Kalesi on yedi günde (24 Haziran 1565) alınmakla beraber, asıl maksat olan Malta'nın ele geçirilmesi başarısız oldu. Şiddetlenen çarpışmalar, Osmanlı ordusunda büyük zaiyatlara yol açtı. Sicilya Genel Valisi'nin İspanya, Fransa ve Papa'nın desteğiyle 72 kadırga ve on bin askerle yardıma gelmesi ve deniz sezonunun sona ermesi nedeniyle kalenin alınamayacağı anlaşılarak kuşatmaya son verildi. Serdar Mustafa Paşa, Turgut Reis gibi büyük bir denizci ve yaklaşık 20.000 askerin şehadetine mal olan bu kuşatmayı kaldırarak, 11 Eylül'de asker ve malzemeyi gemilere yükleyerek dönmeye karar verdi. Bu başarısızlık üzerine, Malta seferi için serdar tayin edilen Mustafa Paşa vezirlikten azledildi.

Fethi için büyük hazırlıklar yapılan ve maalesef büyük zayiatlara sebebiyet veren bu kuşatmanın kaldırılmasına, kalenin hem müstahkem bir mevkide bulunması hem de sağlam surlarla çevrili olmasının yanında ada, gereği gibi abluka altına alınamıyordu. Bu da kaleyi müdafaa edenlere dışarıdan sürekli yardımların gelmesine sebep oluyordu. Kuşatma planında yapılan büyük hatalar, kuşatmanın uzaması nedeniyle donanmanın erzak ve malzeme sıkıntısı ile orduda hastalığın baş göstermesi gibi durumlar, adanın fethine imkân vermemişti.

Kanuni Sultan Süleyman, bu başarısızlığı hazmedemeyerek yeni bir seferin açılması için hazırlıklara başlanmasını emredecektir. Ancak Avrupa'ya yeni bir kara harekâtının yapılma mecburiyeti, bu seferi ikinci plana itmiştir. Bununla beraber Kanuni, son seferi olan Zigetvar'a çıkmadan önce donanmaya denize açılma emrini vermişti. Bu sefer sonunda Sakız Adası bütünüyle Osmanlı hakimiyetine geçecektir.

Donanma, Kanuni'nin emri üzerine harekete geçip denize açılmıştı. Gerçi Sakız Adası, daha Fatih Sultan Mehmed zamanında vergiye bağlanmıştı. Ancak ada sakinleri, fırsat buldukça Osmanlıların askeri harekâtları ile donanmanın durumu hakkında dışarıya bilgi sızdırmaktan geri kalmıyorlardı. Zaman zaman vergilerini aksatıyorlardı. Malta kuşatması sırasında da bazı Sakızlılar, Osmanlılara karşı savaşmışlardı. Tamamen Osmanlı hakimiyetindeki Ege Denizi'nde böyle bir adanın bulunması, Osmanlı menfaatlerine zarar verebilirdi. Katip Çelebi'nin ifadesiyle Kanuni, bütün bu durum ve sebepleri şu sözlerle ifade ediyordu:

"Mısır diyarına giden hacıların yol üzerinde kıyıya yakın Sakız Adası hisarında oturan kâfirler görünüşte haraca bağlı iseler de savaşçı kâfirlerle iyi dostluk üzere olup her daim devlet kapısında olan işleri yazıp bildirmektedirler ve donanma-yi hümayun gemileri çıktıkça kaç gemidir ve ne yana gidecektir hep bildirip ufak İslâm gemilerine zarar eriştirmekten geri durmadıklarını biliyorum. Ne yoldan olursa bu adayı tutup almaya dürisesin."

973 baharında (Mart - Nisan 1566) Kaptan Piyale Paşa 70 parça kadırga ile denize açılıp, adanın karşısındaki Çeşme'ye geldi. Donanmanın Çeşme'ye geldiğini gören Sakızlılar, bazı hediye ve armağanlarla Kaptan Paşa'ya geldilerse de bu, kalenin zaptına mani olamadı. Zira Padişah'ın bu konudaki emri kesindi. Bu sebeple 24 Ramazan 973 (14 Nisan 1566)'da Sakız'a gelen Piyale Paşa, kan dökmeden adayı zapt edip onu bütünüyle Osmanlı hakimiyetine aldı. Buraya muhafızlar koyan Piyale Paşa, büyük kiliseyi de cami haline getirdi. Böylece Ceneviz, Ege'deki son kolonisini de kaybetmiş oluyordu. Türklerin adayı ele geçirmesi, Katolik Cenevizlilerin tazyiklerinden şikayetçi olan yerli Rumlar tarafından sevinçle karşılanmıştı. Sakız Adası da diğer komşu adalar gibi Osmanlı hakimiyetinin sağladığı müsamaha havasından faydalanmıştır.

Sakız Adası'nın artık bütünüyle Osmanlı hakimiyetine girdiği haberini alan Kanuni, "Eyi tedarik olunmuş" diyerek memnuniyetini izhar etmiştir. Piyale Paşa'ya gönderilen hükümde ise Sakız'ın bir sancak halinde Kaptan Paşa eyaletine ilhakı uygun görülmüş ve buranın sancakbeyliği Kırşehir Beyi Gazanfer Bey'e 50.000 akça terakki ile tevcih edilmiştir. Ayrıca Sakız'ın tahriri yapılarak buranın gelirleri ile nüfusu tespit edilmiştir. Bu esnada Sakız'ın ileri gelenleri İstanbul'a gönderilmiştir.